Diagnóstico de amiloidosis renal AA mediante espectrometría de masas en un paciente con proceso inflamatorio crónico grave abdominal

Introducción la amiloidosis es una enfermedad rara, producto del plegamiento y depósito normal de proteínas en tejidos y órganos. Esta enfermedad puede tener un compromiso renal que se manifiesta con síndrome nefrótico y deterioro de la función renal y su etiología puede estar asociada a amiloidosis con compromiso sistémico, siendo la amiloidosis AL y la amiloidosis AA las más frecuentes, esta última está asociada a inflamación crónica grave de origen infecciosa o autoinmune. Para el diagnóstico es fundamental el estudio sistémico multidisciplinario (hematológico, cardiaco, autoinmune, infeccioso y neoplásico), y cuando hay compromiso renal: la biopsia con estudio completo de microscopía de luz, tinciones especiales incluyendo rojo congo, inmunofluorescencia y microscopía electrónica. Cuando no se logra establecer la causa, la espectrometría de masas es una ayuda crucial para el diagnóstico específico. Objetivo se presenta el caso de un paciente con un proceso inflamatorio crónico grave abdominal que evolucionó a síndrome nefrótico por amiloidosis AA, donde la espectrometría de masas ayudó a aclarar el diagnóstico. Presentación del caso se presenta el caso de un paciente con un proceso inflamatorio crónico grave abdominal que evolucionó a síndrome nefrótico por amiloidosis AA, donde la espectrometría de masas ayudó a aclarar el diagnóstico Discusión y conclusiones se considera que la espectrometría de masas es un estudio diagnóstico muy importante para establecer el diagnóstico etiológico de la amiloidosis cuando otros métodos no han logrado establecerlo.

Introduction Amyloidosis is a rare disease, resulting from the accumulation and deposition of insoluble proteins in tissues or organs. This disease may involve the kidney, resulting in nephrotic syndrome and renal failure. The amyloidosis has been associated with systemic involvement, with AL amyloidosis and AA amyloidosis being the most common. The last is associated with various inflammatory disorders as chronic infections and autoimmune diseases. A multidisciplinary approach is required to the diagnosis (hematologic, cardiac, autoimmune, infectious, neoplastic) and in cases of renal involvement, a kidney biopsy with complete study of light microscopy, special stains including congo red, immunofluorescence, electron microscopy is essential for diagnosis. In cases where the cause cannot be stablished, mass spectrometry is practical tool to the identification of the correct type of amyloidosis. Purpose Here, we present a patient with a chronic and severe abdominal inflammatory process that progressed to a nephrotic syndrome due to AA amyloidosis, in which mass spectrometry helped to clarify the diagnosis. Case presentation Here, we present a patient with a chronic and severe abdominal inflammatory process that progressed to a nephrotic syndrome due to AA amyloidosis, in which mass spectrometry helped to clarify the diagnosis Discussion and conclusion Mass spectrometry is considered a useful diagnostic test to confirm the etiology of amyloidosis, especially if other methods are insufficient to establish it.

Identificación directa de microorganismos a partir de hemocultivos positivos utilizando espectrometría de masas (MALDI-TOF MS) / Direct identification of microorganisms in positive blood culture bottles by mass spectrometry (MALDI-TOF MS)

Resumen La espectrometría de masas (MALDI-TOF MS) permite la identificación de microorganismos directamente de las colonias en pocos minutos. En este estudio se ha desarrollado y evaluado un protocolo reducido para identificar microorganismos directamente de las botellas de hemocultivos positivos en 30 minutos con una alta sensibilidad y especificidad, utilizando MALDITOF. Un total de 2535 hemocultivos positivos fueron estudiados por el método directo de MALDI-TOF MS, a partir de una alícuota de sangre de las botellas y el método de colonia, utilizando los cultivos desarrollados en medios sólidos. Del total de hemocultivos positivos incluidos en este estudio, 2381 (93,9%) fueron monomicrobianos y 146 (5,8%) polimicrobianos. Mil trescientos treinta (55,9%) de los aislamientos correspondieron a cocos gram positivos, 922 (38,7%) a bacilos gram negativos, 60 (2,5%) a anaerobios, 36 (1,5%) a bacilos gram positivos y 13 a levaduras. La concordancia global entre ambos métodos fue del 81,7% a nivel de especie (90,0% para bacilos gram negativos, 76,7% para cocos gram positivos y 33,3% para bacilos gram positivos). Se identificó al menos un germen en el 88% de las botellas positivas con desarrollo polimicrobiano. Los resultados del presente estudio demostraron que el protocolo basado en MALDI-TOF MS permite la identificación microbiana directamente de hemocultivos positivos en un tiempo corto, con una alta precisión, con excepción de los bacilos gram positivos.

Abstract Matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS) enables the identification of microorganisms directly from colonies within minutes. In this study this technology was adapted and tested for use with blood culture bottles, thus allowing identification in 30 minutes once the blood culture is detected as positive by the automate. A total of 2535 blood culture bottles reported as positive were tested by MALDI-TOF MS directly from positive blood culture bottles and colonies. A total of 2381 (93.9%) and 146 (5.8%) of the positive blood cultures were monomicrobial and polymicrobial, respectively. And 1330 (55.9%), 922 (38.7%), 60 (2.5%), 36 (1.5%) and 13 of the isolates were gram-positive cocci (GPC), gram-negative bacilli (GNB), anaerobic bacteria, gram-positive bacilli (GPB) and yeast respectively. Concordance between both methods was 81.7% (76.7% of GPC, 90% of GNB, 74.2% of anaerobic bacteria and 33.3% of GPB) in monomicrobial cultures. Eighty eight per cent of the polymicrobial cultures were identified correctly in at least one of the two bacteria. The results of the present study show that this fast, MALDI-TOF MS based method allows microbial identification directly from positive blood culture in a short time, with a high accuracy, with the exception of gram-positive bacilli.

Resumo A espectrometria de massa (MALDI-TOF MS) permite a identificação de microorganismos diretamente das colônias em minutos. Nesse estudo, foi desenvolvido um protocolo reduzido para identificar microrganismos diretamente das garrafas de hemoculturas positivas em 30 minutos com alta sensibilidade e especificidade, utilizando MALDI-TOF. Um total de 2535 hemoculturas positivas foram relatadas -o método direto de MALDI-TOF MS, a partir de uma alíquota de sangue dos vidros e o método de colônia, a partir das culturas desenvolvidas em meios sólidos. Do total de hemoculturas positivas incluídas neste estudo, 2.381 (93,9%) eram monomicrobianas e 146 (5,8%) eram polimicrobianas. Mil trezentos e trinta (55,9%) dos isolados corresponderam a cocos gram-positivos, 922 (38,7%) bacilos gram-negativos, 60 (2,5%) anaeróbios, 36 (1,5%) bacilos gram-positivos e 13 leveduras. A concordância geral entre os dois métodos foi de 81,7% em nivel de especie (90,0% para bacilos gram-negativos, 76,7% para cocos gram-positivos e 33,3% para bacilos gram-positivos). Pelo menos um germe foi identificado em 88% dos vidros positivos com desenvolvimento polimicrobiano. Os resultados do presente estudo demonstraram que o protocolo baseado em MALDI-TOF MS permite a identificação microbiana diretamente de hemoculturas positivas em um curto espaço de tempo, com alta precisão, com exceção de bacilos gram-positivos.

Identificación de especies de micobacterias mediante espectrometría de masas (MALDI-TOF) / Identification of mycobacteria species through mass spectrometry (MALDI-TOF)

Resumen Introducción: Las enfermedades producidas por micobacterias son de gran importancia clínica y epidemiológica presentando el complejo Mycobacterium tuberculosis (MTBc) una morbi-mortalidad mayor que la producida por micobacterias no tuberculosas (MNTB). La identificación tradicional está basada en sus características fenotípicas mediante procesos laboriosos e incapaces en algunos casos de distinguir entre especies. Actualmente, la mayoría de las técnicas utilizadas se basan en métodos moleculares que tienen alta veracidad, pero son complejas y de alto costo. La espectrometría de masas con desorción/ionización láser asistida por una matriz asociada a tiempo de vuelo (MALDI-TOF MS) se basa en la comparación del espectro proteico producido con respecto al de una base de datos de referencia. Objetivo: Evaluar el rendimiento de MALDI-TOF MS en la identificación de micobacterias comparado con métodos moleculares: Material y Métodos: Se analizaron 28 aislados de nueve especies distintas mediante MALDI-TOF MS. Resultados: Se identificó correctamente 78,5% de las aislados (22/28), concordante en 100% (9/9) de MNTB de crecimiento rápido, 60% (9/15) en las MNTB de crecimiento lento y 100% (4/4) de MTBc. Todas las especies no identificadas (6/6) pertenecen al complejo M. avium/intracellulare. Conclusión: MALDI-TOD MS es una metodología rápida, fácil y de bajo costo, con adecuada veracidad respecto a los métodos moleculares.

Abstract Background: Mycobacterial diseases are very important both clinically and epidemiologically. Mycobacterium tuberculosis complex (MTBc) infections confer higher morbidity and mortality rate than non-tuberculous mycobacteria (NTM) infections. Traditional species identification techniques are based on phenotypic characteristics which take a long time by laborious processes and in occasions are no conclusive. Currently, most used techniques are based on molecular methods, which are accurate but are expensive and complex. Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization Time-of-Flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS) is a simple, cheap and fast identification method based on comparing protein spectra with a reference database. Aim: To assess the performance of MALDI-TOF MS in the identification of MTBc and NTM, compared with molecular methods. Methods: For that purpose, 28 isolates of 9 different species were analyzed through MALDI-TOF MS. Results: 78.5% (22/28) of isolates were correctly identified, 100% (9/9) of rapidly growers NTM, 60% (9/15) of slow growing NTM and 100% (4/4) of MTBc. Every unidentified isolate (6/6) corresponded to M. avium/intracellulare complex. Conclusion: MALDI-TOF MS is fast, simple and cheaper than molecular methods and also has adequate accuracy.

Phenolic compounds, biological activities and trace elements of Capparis ovata var. canescens

Introduction: Capparis species (Capparaceae), also called caper, grow naturally in various regions of the world. Caper is a plant with medicinal and aromatic properties. Flower buds, root bark, and fruits of the plant areused in folk medicine due to their analgesic, wound healing,cell regeneration, tonic, and diuretic effects. Objective: The aim of this research was to evaluate in vitro (anti-urease, antioxidant, anticholinesterase) and in vivo (anti-inflammatory) biological activities of caper (C. ovatavar.canescens). In addition, we aimed to identify its major phenolic compounds using high performance liquid chromatography with a photodiode array detector (HPLC-DAD) and confirmate them using quadrupole time-of-flight liquid chromatography with tandem mass spectrometry (Q-TOF-LC/MS). Also, we quantified the concentrations of several trace and major elements in plant samples using inductively coupled plasma-mass spectrometry (ICP-MS). Methods: The antioxidant, anti-urease and anticholinesterase activities of different plant extracts were evaluated using DPPH, FRAP, ABTS/TEAC, Indophenol and Ellman tests. The identification of phenolic compounds and trace element contents was performed using HPLC and Q-TOF-LC/MS and ICP-MS. Results: Soxhlet methanol extract exhibited the strongest anti-urease, antioxidant (ABTS/TEAC) and anticholinesterase activity. Soxhlet and maceration methanol extracts demonstrated significant anti-inflammatory effect in the altered edema size after the second hour of carrageenan injection. The active phenolic compounds in Soxhlet methanol extract were identified as rutin, quercetin-hexoside-hexoside, quercetin-3-O-hexoside and kaempferol-3-O-rutinoside. In addition, the average concentrations of vanadium, chromium, manganese, cobalt, copper, nickel, arsenic, selenium, zinc and lead were within the permissible limits defined by WHO for medicinal plants. However, it was found that the concentrations of cadmium and iron were higher than the maximum permissible limits. Conclusion: Our results suggest that although caper has a strong biological activity, it should be consumed carefully due to the excess amount of cadmium and iron elements it contains.

Introducción: Las especies de Capparis (Capparaceae), también llamadas alcaparras, crecen naturalmente en varias regiones del mundo. La alcaparra es una planta con propiedades medicinales y aromáticas. Los botones florales, la corteza de la raíz y los frutos de la planta se usan en la medicina popular debido a sus efectos analgésicos, cicatrizantes, de regeneración celular, tónicos y diuréticos. Objetivo: El objetivo de esta investigación fue evaluar las actividades biológicas in vitro (anti-ureasa, antioxidante, anticolinesterasa) e in vivo (antiinflamatorio) de la alcaparra (C. ovata var. canescens). Además, nuestro objetivo fue identificar sus principales compuestos fenólicos mediante cromatografía líquida de alto rendimiento con un detector de matriz de fotodiodos (HPLC-DAD) y confirmarlos mediante cromatografía líquida con espectrometría de masas en tándem (Q-TOF-LC/MS). Además, cuantificamos las concentraciones de varios elementos traza y elementos mayores en muestras de la planta utilizando espectrometría de masas con plasma acoplado inductivamente (ICP-MS). Métodos: Se evaluaron las actividades antioxidantes, anti-ureasa y anticolinesterasa de diferentes extractos de la planta usando las pruebas DPPH, FRAP, ABTS/TEAC, Indofenol y Ellman. La identificación de los compuestos fenólicos y el contenido de los elementos traza se realizó mediante HPLC y Q-TOF-LC/MS e ICP-MS. Resultados: El extracto de metanol Soxhlet exhibió la mayor actividad anti-ureasa, antioxidante (ABTS/TEAC) y anticolinesterasa. Los extractos de metanol Soxhlet y por maceración demostraron un efecto antiinflamatorio significativo en el tamaño alterado del edema después de la segunda hora de la inyección de carragenano. Los compuestos fenólicos activos en el extracto de metanol Soxhlet se identificaron como rutina, quercetina-hexósido-hexósido, quercetina-3-O-hexósido y kaempferol-3-O-rutinósido. Además, las concentraciones promedio de vanadio, cromo, manganeso, cobalto, cobre, níquel, arsénico, selenio, zinc y plomo estaban dentro de los límites permisibles definidos por la OMS para las plantas medicinales. Sin embargo, se encontró que las concentraciones de cadmio y hierro fueron más altas que los límites máximos permitidos. Conclusión: Nuestros resultados sugieren que, aunque la alcaparra tiene una fuerte actividad biológica, debe consumirse con cuidado debido al exceso de cadmio y hierro que contiene.

Identificación directa de microorganismos a partir de muestras de orina y hemocultivos utilizando MALDI-TOF / Direct identification of microorganisms in urine and blood cultures samples, using MALDI-TOF MS

Objetivo: evaluar la utilidad de la identificación directa de microorganismos en muestras de orina y hemocultivos empleando la tecnología MALDI-TOF MS, mediante el análisis de concordancia en la identificación, tiempo necesario para la obtención de un resultado y costos asociados a cada método de identificación. Materiales y métodos: estudio descriptivo de febrero de 2017 a octubre de 2017. Se seleccionaron a conveniencia 180 muestras de orinas y 129 hemocultivos de pacientes de la Clínica El Rosario, Medellín, se realizó identificación del microorganismo directamente de la muestra y a partir del cultivo por MALDI-TOF (Vitek® MS‚ bioMérieux). Se analizaron los costos y tiempo, para determinar la utilidad de esta tecnología en los procesos del laboratorio de microbiología. Resultados: En el 79,6% de las orinas positivas y en el 76% de los hemocultivos se obtuvo una identificación de microorganismos directamente por MALDI-TOF MS. El tiempo de identificación directa tuvo una media de 6 horas y por cultivo una media de 29 horas. El costo total por aislamiento identificado de forma directa (sin incluir el valor del equipo) fue de $8.200 (2,58 USD) en muestras de orina y de $9.720 (3,06 USD) en hemocultivos positivos. El equipo introduce un costo variable en cada identificación de acuerdo con el número de identificaciones que se realicen en el laboratorio. Conclusiones: Estos resultados confirman la utilidad del MALDI-TOF MS para generar identificaciones más rápidas cuando se utiliza directamente en muestras clínicas, sin embargo, tiene un bajo desempeño en la identificación directa de bacterias gram positivas, siendo necesario evaluar otros protocolos que mejoren la identificación directa. El costo de los consumibles es bajo, pero la adquisición de esta tecnología introduce un costo variable que depende del volumen de muestras identificadas en el laboratorio.

Objective: To evaluate the utility of the direct identification of microorganisms in urine and blood cultures samples, using MALDI-TOF by evaluating concordance for identification, time to obtain an identification result and associated costs. Materials and Methods: A descriptive study from February to October 2017 in 180 urine samples and 129 positive blood cultures samples of patients from the El Rosario Clinic in Medellin- Colombia. The clinical samples were processed directly for microorganisms identification by using MALDI-TOF (Vitek® MS‚ bioMérieux). This result was compared with the result obtained with Maldi tof -MS done for the cultured microorganism. An analysis of cost and time to achieve an identification result was made to determinate the utility of this technology in the laboratory procedures. Results: 79,6 % of positive urines and the 76 % of blood cultures were identified directly from the sample by MALDI-TOF. MALDI-TOF applied directly had a mean time for obtaining an identification of 6 hours compared to 29 hours to obtain an identification from cultures. The cost of direct identification was $8.200 (2,58 USD) in urine samples and $9.720 (3,06 USD) in blood cultures (without including the equipment cost). This cost is variable depending of the number of identifications that the laboratory performs. Conclusions: These results support the usefulness of MALDI-TOF for getting rapid identification results using the direct methodology in clinical samples. However, the capability to identify gram positive bacteria needs to be improved. The incorporation of this methodology in microbiology laboratories may improve the opportunity in the etiological diagnosis and should have a positive impact on patient care.

Evaluación de MALDI-TOF MS para la identificación de levaduras patógenas oportunistas de muestras clínicas / Evaluation of MALDI-TOF MS for the identification of opportunistic pathogenic yeasts of clinical samples

Resumen La espectrometría de masas MALDI-TOF MS es una técnica rápida y sencilla para identificar microorganismos por análisis proteico. Se estudiaron 304 aislados de levaduras procedentes de micosis superficiales y profundas, con el objetivo de comparar tres métodos: convencional (bioquímico y morfológico), MALDI-TOF MS, y reacción en cadena de la polimerasa (RPC, método de referencia). Se estudiaron 24 especies con predominio de Candida spp y Cryptococcus spp. La identificación por método convencional fue de 258/304 cepas, mientras que por MALDI-TOF MS fue de: 277/304 cepas (84,8 versus 91,2%, p = no significativo). El coeficiente Kappa entre el MALDI-TOF MS y la RPC reportó una excelente concordancia (0,99). La sensibilidad y la especificidad de MALDI-TOF MS para la identificación de levaduras patógenas oportunistas de muestras clínicas fueron de 94,6% y 99%; respectivamente. MALDI-TOF MS demostró ser una herramienta de alta precisión para la identificación de levaduras patógenas.

MALDI-TOF MS mass spectrometry is a rapid and straightforward technique to identify microorganisms by protein analysis. The study was performed in 304 yeast isolates from superficial and deep mycoses, in order to compare three methods: conventional (biochemical and morphological), MALDI-TOF MS, and polymerase chain reaction (PCR, reference). We included 24 species with predominance of Candida spp and Cryptococcus spp. The identification by conventional methods was 258/304 strains, while by MALDI-TOF MS was: 277/304 strains (84.8% versus 91.2%, P = not significant). The Kappa coefficient comparing MALDI-TOF-MS with PCR reported excellent concordance (0.99). The sensitivity and specificity of MALDI-TOF MS for the diagnosis of opportunistic pathogenic yeasts of clinical samples were 94.6% and 99% respectively. MALDI-TOF MS is a simple, fast and reliable tool for pathogenic yeasts.

Determinación y comparación cualitativa de cannabinoides presentes en productos naturales comerciales del departamento del Cauca, Colombia / Determination and qualitative comparison of cannabinoids present in commercial natural products of the Cauca Department-Colombia

RESUMEN Actualmente, hay un creciente interés por el estudio de Cannabis sativa y sus componentes ya que se le atribuye propiedades terapéuticas en el tratamiento de enfermedades. En Colombia y específicamente en el departamento del Cauca se comercializan productos de cannabis tanto para fines no medicinales como terapéuticos. En consecuencia, es necesario el análisis de estos productos de manera que se pueda conocer la composición de los mismos y el posible efecto que pueda tener sobre la salud. El análisis de los componentes de estos productos se llevó a cabo empleando la cromatografía líquida de alta resolución (CLAR) y espectrometría de masas (EM), de tal manera que permitieron la identificación de las principales especies cannabinoides; Δ9-tetra hidrocannabinol (THC), cannabidiol (CBD), cannabinol (CBN), cannabigerol (CBG). La separación de los analitos se llevó a cabo mediante la implementación de una columna analítica C18 de fase reversa, elución isocrática 1 mL/ min, presión del sistema 800 PSI, una mezcla de acetonitrilo ACN y buffer fosfato (KHPO4) en relación 65/35 como fase móvil, volumen de inyección de 10 µL, un tiempo de análisis de 15 min, y detección a 220 nm.

SUMMARY Cannabis sativa has now experienced an increasing interest in the study of its components since it is attributed therapeutic properties in the treatment of diseases. In Colombia and specifically in the Cauca Department, Cannabis products are marketed both for non-medicinal and therapeutic purposes. Consequently, it is necessary to analyze these products in such a way that the composition of the products and their possible effect on health can be known. The analysis ofthe components of these products was carried out using high performance liquid chromatog-raphy (HPLC) and mass spectrometry (MS), in such a way that they allowed the identification of the main cannabinoid species; Δ9-tetra hydrocannabinol (THC), cannabidiol (CBD), cannabinol (CBN), cannabigerol (CBG). The separation of the analytes was carried out by means of the implementation of a reverse phase C18 analytical column, isocratic elution 1 mL/min, system pressure 800 PSI, a mixture of acetonitrile ACN and phosphate buffer (KHPO4) in relation 65/35 as mobile phase, injection volume of10 µL, analysis time of15 min, and detection at 220 nm.

Bacteriemia por Helicobacter cinaedi: presentación de los primeros casos descritos en Argentina / Helicobacter cinaedi bacteremia: Presentation of the first cases reported in Argentina

Se presentan 2 casos de bacteriemia por Helicobacter cinaedi. El primero se diagnosticó en un varón de 76 años y resultó secundario a la colocación de un acceso vascular; el segundo correspondió a un lactante febril de 37 días de vida, asociado a un cuadro de gastroen-terocolitis aguda. H. cinaedi es un microorganismo que presenta dificultad para desarrollarse en diferentes medios de cultivo y lograr su identificación a nivel de especie. En ambos casos fue fundamental la observación microscópica en fresco de las botellas de hemocultivo, la utilización de la espectrometría de masas y la posterior secuenciación del gen hsp60 para llegar a esa instancia. En los últimos anos se han informado infecciones por H. cinaedi con frecuencia creciente en otras partes del mundo. En este trabajo presentamos los primeros casos de bacteriemia por H. cinaedi documentados en Argentina.

Two cases of bacteremia caused by Helicobacter cinaedi are presented. The first case was diagnosed in a 76-year-old male patient, and was secondary to a vascular access device placement; the second case corresponded to a febrile infant of 37 days of life, and was associated with acute gastroenteritis. H. cinaedi is a microorganism difficult to grow in different culture media and also to identify to species level. In both cases, the microscopic observation of blood culture bottles, the use of mass spectrometry and the subsequent sequencing of the hsp60 gene were essential. In the recent literature, H. cinaedi infections are being reported more frequently. In this report we present the first documented cases of bacteremia caused by H. cinaedi in Argentina.

Método cualitativo rápido ( screening ) para ladetección de residuos de plaguicidas en frutas y hortalizas / Qualitative screening method for pesticide residues detection in fruits and vegetables / Método qualitativo rápido (screening) para a detecção de resíduos de pesticidas nas frutas e nos vegetais

Resumen Debido a la importancia de desarrollar metodologías que permitan el análisis de los residuos agrícolas, el presente trabajo validó un método cualitativo rápido (screening) para el análisis de residuos de plaguicidas en frutas y hortalizas. La metodología se basó en el método de extracción QuEChERS, versión europea, con un paso adicional de limpieza por cromatografía de permeación por gel (GPC), lo cual permitió reducir la cantidad de componentes de la matriz en el extracto final. El análisis fue realizado por cromatografía de gases/espectrometría de masas con un analizador cuadrupolo simple. La metodología resultó adecuada para el análisis cualitativo de 31 plaguicidas a su respectivo límite máximo de residuos. Los resultados en muestras reales fueron consistentes respecto a una metodología cuantitativa de rutina, por ende, la metodología resultó ser una buena alternativa para el análisis rápido de estos contaminantes.

Abstract Because of the importance of developing methodologies that allow agricultural residues analysis, a rapid screening qualitative method for the determination of pesticides residues in fruits and vegetables was validated. The methodology was based on the European QuEChERS extraction method with an additional cleaning step by gel permeation chromatography (GPC), which helped to reduce the number of matrix components in the final extract. The analysis was carried out by gas chromatography coupled to mass spectrometry with a single quadrupole analyzer. The methodology was appropriate for the qualitative analysis of 31 pesticides at their respective maximum residue limits. Consistent results were obtained with respect to a quantitative routine methodology in the analysis of real samples, hence the methodology was proven to be a good alternative for the fast analysis of these contaminants in fruits and vegetables.

Resumo Devido à importância de desenvolver metodologias que permitam analisar os resíduos agrícolas, o presente trabalho validou de um método qualitativo rápido (screening) para a análise de resíduos de pesticidas nas frutas e vegetais. A metodologia foi baseada no método de extração QuEChERS versão Europeia com um passo adicional de limpeza por meio de cromatografia de permeação em gel (GPC), o que permitiu reduzir a quantidade de componentes de matriz no extrato final. A análise foi realizada por cromatografia gasosa/espectrometria de massa com um analisador de quadrupolo simples. A metodologia foi adequada para a análise qualitativa de 31 pesticidas aos seus respectivos limites máximos de resíduos. Os resultados obtidos em amostras reais foram consistentes com uma metodologia quantitativa de rotina, portanto, a metodologia estudada tem demonstrado ser uma boa alternativa para a análise rápida destes contaminantes em frutas e vegetais.

La espectrometría de masas MALDI-TOF en el laboratorio de microbiología clínica / MALDI-TOF mass spectrometry in clinical microbiology laboratories

Los métodos fenotípicos empleados para la identificación de microorganismos dependen de procesos metabólicos que requieren de tiempos de incubación mínimos para alcanzar resultados confiables. La espectrometría de masas MALDI-TOF (desorción/ionización láser asistida por una matriz con detección de masas por tiempo de vuelo) se ha instaurado como una metodología relevante para la identificación de microorganismos mediante el análisis de proteínas, a través de la creación de un espectro de masas específico de género y especie. En esta revisión, se presenta MALDI-TOF MS como una tecnología precisa para la identificación de bacterias, levaduras, mohos, en incluso de virus ,que además, permite la reducción del tiempo para obtener un resultado de identificación, que puede impactar los costos de atención y duración de la estancia hospitalaria. La identificación de microorganismos directamente de muestras biológicas y la detección de mecanismos de resistencia a antimicrobianos, prometen un mayor impacto clínico y epidemiológico con el desarrollo e implementación de esta tecnología en los laboratorios de microbiología clínica.

Phenotypic methods used for the identification of microorganisms depend on metabolic processes that require minimum incubation times to achieve reliable results. For this reason, MALDI-TOF MS (Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization Mass Spectrometry) has been established as a relevant methodology for the identification of microorganisms using analysis of proteins, through the creation of a mass spectrum specific for genus and species. In the present review, MALDI TOF MS is presented as an accurate technology for identifying bacteria, yeasts, molds and viruses; Its use allows reduction of the time to obtain an identification result, which may impact the costs of care and length of hospital stay. The identification of microorganisms directly from biological samples and the detection of mechanisms of antimicrobial resistance, promise an additional clinical and epidemiological impact with the development and implementation of this technology in clinical microbiology laboratories.

INFLUENCE OF USING HYDROCHLORIC ACID FOR MEASURING THE CONCENTRATION OF TOTAL CARNITINE IN HUMAN PLASMA BY TANDEM MASS SPECTROMETRY / INFLUENCIA DEL USO DE ÁCIDO HIDROCLÓRICO PARA MEDIR LA CONCENTRACIÓN DE LA CARNÍTINA TOTAL EN EL PLASMA HUMANO POR ESPECTROMETRÍA DE MASAS EN TANDEM

The present study establishes whether the pH of samples is crucial for measuring total carnitine in human plasma by tandem mass spectrometry and if it is necessary to neutralize the samples after alkaline hydrolysis of acylcarnitines. Free and total carnitine of ten plasma samples were measured by a radioenzymatic assay as a reference method, and forward there were analyzed by tandem mass spectrometry divided into two groups: treated with hydrochloric acid and without hydrochloric acid measuring each sample five times for both variables. Free and total carnitine concentrations were similar for the radioenzymatic essay and tandem mass spectrometry. There was no significant difference between the two analyzed variables (treated with hydrochloric acid and without hydrochloric acid). It could be concluded that the pH of samples is no crucial for measuring total carnitine in plasma by tandem mass spectrometry, and it is not necessary to neutralize the samples after alkaline hydrolysis of acylcarnitines, then the shorter method, without adding hydrochloric acid can be used for total carnitine measurement in plasma by tandem mass spectrometry.

El presente estudio establece, si el pH al cual se procesan las muestras, condiciona la determinación de la carnitina total en plasma, mediante el uso de espectrometría de masas en tándem; así mismo analiza, si es necesario neutralizar las muestras luego de la hidrólisis alcalina de las acilcarnitinas. Carnitina libre y total de 10 muestras de plasma fueron medidas mediante el ensayo radioenzimático, como método de referencia. Posteriormente fueron medidas cinco veces cada muestra, mediante espectrometría de masas en tándem utilizando ácido hidroclorhídrico y sin usar ácido hidroclorhídrico. Las concentraciones de carnitina libre y total, fueron similares utilizando ensayo radioenzimático y espectrometría de masas en tándem. No se encontró diferencias significativas entre las dos variables analizadas (con ácido hidroclorhídrico, o sin ácido hidroclórhídrico). Puede concluirse que el pH de las muestras no es crucial para medir carnitina total en plasma por espectrometría de masas en tandem y no es necesario neutralizar las muestras luego de la hidrólisis alcalina de las acilcarnitinas. El método más corto puede ser utilizado para tal fin.

Búsqueda de biomarcadores a partir de péptidos expresados en biopsias de cáncer de mama / Search for biomarkers from peptides expressed in breast cancer biopsies / Busca de biomarcadores a partir de peptídeos expressos em biópsias câncer de mama

El cáncer de mama (CM) es una de las principales causas de muerte en México. Se ha observado un incremento en la incidencia de éste en mujeres de 15-29 años. A fin de comprender las causas en el desarrollo del CM, se pretendió buscar la asociación entre los genes/enfermedad empleando técnicas de Biología Molecular. Se analizaron, por genómica funcional, 50 biopsias frescas de pacientes con CM (BFCM), 50 biopsias embebidas en parafina de CM (BEPCM) y 10 biopsias frescas de pacientes con sospecha de CM (BFSC), obtenidas de mujeres que residen en Coahuila, México. Las muestras proteicas se cuantificaron y se resolvieron en geles de poliacrilamida dodecil sulfato de sodio (SDS-PAGE) y en dos dimensiones (2-DE). El perfil proteico de las BFCM, BEPCM versus BFSC mostró diferencias entre las bandas peptídicas observadas en los geles. Aquellos péptidos que se diferenciaron por su expresión fueron analizados por cromatografía líquida acoplada a masas en tándem (LC/ MS/MS). Las huellas peptídicas obtenidas, a su vez, se analizaron por medio del banco de genes (PubMed). Se encontraron, en las muestras de cáncer, proteínas asociadas a migración celular, supresión de tumores, estrés oxidativo y choque térmico. Por último, estos hallazgos se confirmaron empleando inmuno-electro transferencia o Western blot (WB) con anticuerpos contra vimentina.

Breast cancer (BC) is one of the leading causes of death in Mexico. Moreover, BC is the main cause of death in women between 15-29 years old in northern Mexico. Proteomic techniques have been used in order to achieve a better understanding of the genes involved in the development of BC. The proteins in BC extracted from 50 fresh breast cancer tissues (FBCT), 50 paraffin embedded breast cancer tissues (PEBCT) and 10 biopsies from women suspected of cancer (SC), residing in Coahuila, Mexico were analyzed in this paper. The quantity of protein extracted was similar in both samples FBCT and PEBCT. However, protein quality was lower in PEBCT than FBCT. Subsequently, these proteins were resolved in SDS-PAGE and 2DE. Differences were noticed in protein profile and all those suspect proteins were analyzed by LC/MS/MS. Amino acidic fingerprint allowed for the identification of peptides associated with a) cell migration, b) tumor suppression, c) oxidative stress or heat shock.

O câncer da mama (CM) é uma das principais causas de morte no México. Observou-se um aumento na incidência desse câncer em mulheres entre os 15-29 anos de idade. Para compreender as causas do desenvolvimento de CM, visou-se encontrar a associação entre os genes/doença utilizando técnicas de Biologia molecular. Analisaram-se por genômica funcional, 50 biópsias frescas de pacientes com CM (BFCM), 50 biópsias embebidas em parafina (BEPCM) e 10 biópsias frescas de pacientes com suspeita de CM (BFSC), obtidas de mulheres residentes em Coahuila, México. As amostras de proteínas foram quantificadas e separadas em géis de poliacrilamida dodecil sulfato de sódio (SDS-PAGE) e em duas dimensões (2-DE). O perfil proteico das BFCM, BEPCM comparado com BFSC mostrou diferenças entre as bandas peptídicas observadas nos géis. Esses peptídeos que diferem em sua expressão foram analisados por cromatografia líquida acoplada a massas em tandem (LC/MS/MS). As pegadas peptídicas obtidas, por sua vez, foram analisadas utilizando o banco de genes (PubMed). Verificaram-se nas amostras de câncer, proteínas associadas à migração celular, supressão de tumores, estresse oxidativo e choque térmico. Finalmente, estes achados foram confirmados utilizando a imuno-eletro transferência ou Western Blot (WB) com anticorpos contra vimentina.

Validación de una metodología analítica para determinar bifenilos policlorados en muestras de plasma sanguíneo / Validation of an analytical methodology to determine polychlorinated biphenyls in samples from blood plasma

Resumen Introducción. Los bifenilos policlorados se encuentran entre los cinco contaminantes orgánicos persistentes más tóxicos para los organismos vivos, según la Agency for Toxic Substances and Disease Registry (ATSDR) de los Estados Unidos. Objetivo. Estandarizar y validar un método analítico para la determinación y cuantificación de los bifenilos policlorados indicadores en muestras de plasma sanguíneo, mediante cromatografía de gases acoplada a espectrometría de masas. Materiales y métodos. Se fortificó un pool de plasma para hacer los ensayos en la matriz. Además, se utilizó el material de referencia NIST SRM ® 1958 (Organic Contaminants in Fortified Human Serum, Freeze-Dried) para los ensayos de veracidad y precisión intermedia. Resultados. Los porcentajes de recuperación obtenidos con la metodología estuvieron entre 88,4 y 97,5 %, y el sesgo fue menor del 20 %. Los límites de detección y cuantificación de los bifenilos policlorados indicadores policlorados fueron de 0,04 µg/L y 0,10 µg/L, respectivamente. La linealidad representada por el coeficiente de determinación (R2) varió entre 0,9866 y 0,9886. La precisión expresada como desviación estándar relativa fue menor del 20 % en todo el rango lineal de trabajo (0,5-500 µg/L). Por último, se analizaron 115 muestras de población colombiana de diferentes zonas del país y se encontraron 65 muestras positivas, de las cuales dos estuvieron por encima de los valores de control biológico en humanos (Human Biomonitoring Values, HBM- II): 7,0 µg/L, 2XΣPCB 138, 153, 180 , y otras dos, por encima del HBM-I: 3,5 µg/L, 2XΣPCB 138, 153, 180. Conclusión. El método desarrollado resultó ser preciso para el análisis de los bifenilos policlorados en muestras de plasma sanguíneo y se puede utilizar para el control biológico de estos contaminantes en población colombiana.

Abstract Introduction: Polychlorinated biphenyls are among the five most toxic persistent contaminants for living organisms according to the Agency for Toxic Substances and Disease Registry (ATSDR). Objective: To standardize and validate an analytical method to determine and quantify polychlorinated biphenyl indicators in samples from blood plasma by means of gas chromatography-mass spectrometry. Materials and methods: We fortified a plasma pool to do the matrix assays. Additionally, we used the NIST SRM® 1958 reference material for the veracity and intermediate accuracy assays. Results: Methodology recovery percentages ranged between 88.4 and 97.5%, and the bias was less than 20%. Detection and quantification limits were 0.04 µg/L and 0.10 µg/L, respectively, for all polychlorinated biphenyl indicators. The linearity represented by the determination coefficient (R2 ) varied between 0.9866 and 0.9886. Accuracy, expressed as relative standard deviation was less than 20% in all the linear work range (0.5-500 µg/L). Finally, we analyzed 115 samples from Colombian population in various zones of the country and we found 65 positive samples, from which two samples were above HBM-II (7.0 µg/L, 2XΣPCB 138, 153, 180), and two, above HBM-I (3.5 µg/L, 2XΣPCB 138, 153, 180 ). Conclusion: The method we developed is accurate for PCB analysis in blood plasma samples and could be used for biological surveillance of these contaminants in the Colombian population.

Análisis proteómico de los productos de excreción-secreción de cuatro aislados de Trichinella spiralis obtenidos de hospederos accidentales / Proteomic analysis of the excretion-secretion products of four Trichinella spiralis isolates obtained from accidental hosts

Resumen: Introducción: Trichinella spiralis es un nemátodo tisular que se aloja en el músculo esquelético de humanos y otros mamíferos y causa una serie de alteraciones fisiológicas. Las proteínas de los productos de excreción-secreción de T. spiralis juegan un papel importante en la aparición y regulación de estas alteraciones. Sin embargo, aún no se conoce el efecto de estos productos en la infección e invasión del parásito al hospedero. Métodos: Mediante un análisis electroforético en una dimensión, Western blot y espectrometría de masas, se evaluaron las diferencias y similitudes entre proteínas antigénicas y de superficie de cuatro aislados de T. spiralis obtenidos de hospederos accidentales (perros) y la cepa de referencia aislada de cerdos (MSUS/MEX/91/CM). Resultados: Utilizando ontología de genes, se encontraron cinco proteínas exclusivas de los hospederos accidentales. Después del análisis, se encontró que estas proteínas forman parte de la matriz extracelular del parásito, cuentan con actividad catalítica y están implicadas en la adhesión a las células del hospedero. La actividad antigénica de las cuatro cepas aisladas de hospederos accidentales es idéntica a la reportada para T. spiralis, visualizándose el triplete antigénico característico de 43, 45 y 47 kDa. Conclusiones: Las proteínas exclusivas de los hospederos accidentales proveen información para entender el mecanismo de acción de este parásito para penetrar el músculo y evadir la respuesta inmune en el hospedero.

Abstract: Background: Trichinella spiralis is an intestinal and tissue nematode specific for mammalian skeletal muscle, causing a series of physiological alterations. T. spiralis excretory-secretion products play an important role in the appearance and regulation of these alterations. However, the effect of these products on the infection and invasion of the parasite to the host is unknown. Methods: Differences and similarities between antigenic proteins and surface proteins of four accidental hosts isolates (dogs) of T. spiralis and the reference strain isolated from pigs (MSUS/MEX/91/CM) were assessed by electrophoresis, western blot and mass spectrometry. Results: Using gene ontology, five proteins exclusive to the accidental hosts were analyzed. The results showed that these proteins are part of the extracellular matrix of the parasite, present catalytic activity, and bind to host cells. The antigenic activity the four strains showed the antigenic triplet characteristic of T. spiralis of 43, 45 and 47 kDa. Conclusions: Five proteins exclusive to dog isolates provided information to understand the mechanism of action of this parasite to penetrate the muscle and evade the immune response in the host.

Reference values of amino acids, acylcarnitines and succinylacetone by tandem mass spectrometry for use in newborn screening in southwest Colombia / Valores de referencia de aminoácidos, acilcarnitinas y succinilacetona por espectrometría de masas en tándem para su uso en el tamizaje neonatal en el suroccidente de Colombia

Abstract Introduction: Inborn errors of metabolism (IEM) represent an important public health problem due to current diagnosis and treatment limitations, poor life quality of affected patients, and consequent untimely child death. In contrast to classical methods, tandem mass spectrometry (MS/MS) has allowed simultaneous evaluation of multiple metabolites associated with IEM offering higher sensitivity, low false positive rates and high throughput. Aims: Determine concentration levels for amino acids and acylcarnitines in blood of newborns from Colombia, to establish reference values for further use in diagnosis of IEM. Methods: Implementation of a method to determine amino acids, acylcarnitines and succinylacetone in newborn dried blood spots using MS/MS, and its application in a cross-sectional study conducted in 891 healthy neonates from Cali and Quibdo cities is described. Results: fifty-seven analytes that allow the diagnosis of more than 40 different pathologies were tested. The method showed to be linear, precise and accurate. Healthy neonates 1-18 days of age were included, 523 from Cali and 368 from Quibdo; 52% male and 48% female. Age-related differences on the concentration levels of amino acids and acylcarnitines were observed whereas no significant differences by gender were found. Conclusion: The study has contributed to reveal the usual concentration levels of amino acids, acylcarnitines and succinylacetone that could be used as reference for the establishment of a newborn metabolic screening program in Colombia.

Resumen Introducción: Los Errores Innatos del metabolismo (EIM) representan un importante problema de salud pública debido a limitaciones en el tratamiento y diagnóstico oportuno, la pobre calidad de vida de los pacientes afectados, así como la muerte infantil prematura. Comparada con los métodos clásicos, la espectrometría de masas en tándem (MS/MS) ha permitido la evaluación simultánea de múltiples metabolitos asociados con EIM, con una alta sensibilidad, baja proporción de falsos positivos y alto rendimiento. Objetivos: Determinar los niveles de concentración de aminoácidos y acilcarnitinas en sangre de recién nacidos de Colombia, para establecer los valores normales para usarlos como referencia en el diagnóstico de EIM. Métodos: Aquí, se describe la implementación de un método para determinar aminoácidos, acilcarnitinas y succinilacetona en gotas de sangre seca de recién nacidos usando MS/MS, y su aplicación en un estudio de corte transversal realizado en 891 neonatos sanos de las ciudades de Cali y Quibdó. Resultados: Se evaluaron 57 analitos que permiten el diagnóstico de más de 40 patologías diferentes. El método mostró ser lineal, preciso y exacto. Se incluyeron neonatos sanos de 1-18 días de edad, 523 de Cali y 368 de Quibdó, 52% hombres y 48% mujeres. Se observaron diferencias en los niveles de concentración de aminoácidos y acilcarnitinas relacionadas con la edad, mientras que no se encontraron diferencias significativas por sexo. Conclusión: El estudio ha contribuido a revelar los niveles usuales de concentración de aminoácidos, acilcarnitinas y succinilacetona que pueden ser usados como referencia para el establecimiento del programa de tamizaje neonatal metabólico en Colombia.

Displacers improve the selectivity of phosphopeptide enrichment by metal oxide affinity chromatography / Uso de desplazadores para mejorar la selectividad de los fosfopéptidos enriquecidos por cromatografía de afinidad con óxidos de metales

Abstract: Background: A key process in cell regulation is protein phosphorylation, which is catalyzed by protein kinases and phosphatases. However, phosphoproteomics studies are difficult because of the complexity of protein phosphorylation and the number of phosphorylation sites. Methods: We describe an efficient approach analyzing phosphopeptides in single, separated protein by two-dimensional gel electrophoresis. In this method, a titanium oxide (TiO2)-packed NuTip is used as a phosphopeptide trap, together with displacers as lactic acid in the loading buffer to increase the efficiency of the interaction between TiO2 and phosphorylated peptides. Results: The results were obtained from the comparison of mass spectra of proteolytic peptides of proteins with a matrix-assisted laser desorption-ionization-time of flight (MALDI-TOF) instrument. Conclusions: This method has been applied to identifying phosphoproteins involved in the symbiosis Rhizobium etli-Phaseolus vulgaris.

Resumen: Introducción: Un proceso clave en la regulación celular es la fosforilación de proteínas, que se lleva a cabo por cinasas y fosfatasas. Sin embargo, los estudios de fosfoproteómica son difíciles debido a la complejidad de la fosforilación proteica y el número de sitios de fosforilación. Métodos: En el presente trabajo se describe una eficiente estrategia metodológica para analizar fosfopéptidos de proteínas separadas mediante electroforesis bidimensional. En este método, una columna con microesferas de dióxido de titanio (TiO2/NuTip) se utilizó para atrapar los fosfopéptidos en la superficie del TiO2 previamente empacado en una punta. El uso de desplazadores en el buffer de carga, como el ácido láctico, mejoró significativamente la selectividad. Resultados: Los resultados se obtuvieron mediante la comparación de los espectros de masas de péptidos proteolíticos de proteínas analizados utilizando un instrumento de desorción/ionización láser asistida por matriz-tiempo de vuelo (MALDI-TOF). Conclusiones: Este método se ha aplicado para la identificación de fosfoproteínas involucradas en la simbiosis del Rhizobium etli con Phaseolus vulgaris.

MALDI imaging: beyond classic diagnosis / Imagenología por MALDI: más allá del diagnóstico clásico

Abstract: Mass spectrometry has been the focus of technology development and application for imaging for several decades. Imaging mass spectrometry using matrix-assisted laser desorption ionization is a new and effective tool for molecular studies of complex biological samples such as tissue sections. As histological features remain intact throughout the analysis of a section, distribution maps of multiple analytes can be correlated with histological and clinical features. Spatial molecular arrangements can be assessed without the need for target-specific reagents, allowing the discovery of diagnostic and prognostic markers of different cancer types and enabling the determination of effective therapies.

Resumen: La espectrometría de masas ha sido el foco de atención del desarrollo y aplicación de tecnología para imagenología por varias décadas. La imagenología por espectrometría de masas utilizando ionización por desorción láser asistida por matriz es una herramienta novedosa y efectiva para el estudio molecular de muestras biológicas complejas como los cortes de tejidos. Ya que las características histológicas se mantienen intactas durante el análisis de una sección, pueden correlacionarse mapas de distribución de múltiples analitos con características clínicas e histológicas. Los arreglos moleculares espaciales pueden evaluarse sin la necesidad de reactivos específicos para el blanco, lo que permite el descubrimiento de marcadores pronósticos y diagnósticos de diferentes tipos de cáncer y permite la determinación de terapias efectivas.

Espectrometría de masas MALDI-TOF: evaluación de la etapa preanalítica para la identificación de hongos miceliales / MALDI-TOF mass spectrometry: Evaluation of the preanalytical phase for identification of molds

Se evaluaron 3 metodologías de extracción de proteínas para la identificación de hongos miceliales por MALDI-TOF MS en 44 aislados: la extracción con agua-ácido fórmico (E. agua), la extracción con zirconio-etanol-acetonitrilo-ácido fórmico (E. zirconio) y la recomendada por el proveedor del equipo (E. tubo). Se compararon 2 bases de datos: Bruker (BK) y BK + National Institutes of Health. Los resultados obtenidos utilizando dichas bases fueron los siguientes (en el orden citado): identificación correcta (IC) a nivel de género, 10 y 16 con E. agua; 27 y 32 con E. zirconio y 18 y 23 con E. tubo; IC a nivel de especie, 5 y 7 con E. agua; 17 y 20 con E. zirconio y 11 y 14 con E. tubo; identificaciones no confiables, 18 y 12 con E. agua y 9 y 4, tanto con E. zirconio como con E. tubo; ausencia de pico, 16 con E. agua, 8 con E. zirconio y 17 con E. tubo. La extracción con zirconio mostró el mejor rendimiento (p < 0,05).

In order to optimize the identification of molds with MALDI-TOF MS, three protein extraction-methodologies were evaluated against 44 isolates: water extraction (WE), zirconium extraction (ZE) and the provider's recommended method (PRM). Two data bases were compared, Bruker (BK) and Bruker + National Institutes of Health. Considering both databases, results were respectively as follows: correct identification (CI) at gender level, 10 and 16 by WE; 27 and 32 by ZE and 18 and 23 by PRM; CI at species level, 5 and 7 by WE; 17 and 20 by ZE and 11 and 14 by PRM; non-reliable identification, 18 and 12 by WE; 9 and 4 by ZE and by PRM. No peaks were observed in 16 by WE, 8 by ZE and 17 by PRM. ZE showed the best perfomance (p < 0.05).

Determinación del efecto cicatrizante de Piper aduncum (matico) en fibroblastos humanos / Determination of the healing effect of Piper aduncum (spiked pepper or matico) on human fibroblasts

RESUMEN Objetivos. Evaluar el efecto cicatrizante del extracto hidroetanólico de Piper aduncum, en una línea celular de fibroblastos Dermales Adultos Humanos (hDFa). Materiales y métodos. El extracto se obtuvo mediante extracción sólido-líquido, fue concentrado y liofilizado. Se purificaron las proteínas del extracto mediante cromatografía líquida de alta eficacia de fase reversa (RP-HPLC); las proteínas fueron identificadas por espectrometría de masas en tándem de péptidos trípticos y se analizaron por MALDI-TOF-TOF en un espectrómetro de masa ABSciex4800. Los valores de concentración efectiva media (EC50), concentración inhibitoria media (IC50), y el porcentaje de proliferación celular; fueron determinados por ensayos con sales de tetrazolio (MTT) . La migración celular se evaluó mediante la "técnica de rayado" . Se analizó la expresión de factores de crecimiento mediante el ensayo de reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa reversa a tiempo real (RT- qPCR). Resultados. La línea hDFa evidenció un IC50 de 200 µg/mL con el extracto, el valor de EC50 fue 103,5 µg/mL. En el ensayo de proliferación, la proteína K2; mostró mayor actividad en la proliferación respecto de otros tratamientos (1 µg/mL). En el ensayo de migración de fibroblastos, la proteína K2 mostró mayor actividad (50 µg/mL). La expresión relativa del factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) se incrementó 8,6 veces respecto al control, en presencia de la proteína K2. Conclusiones. El extracto hidroetanólico, de Piper aduncum, así como las proteínas que contiene, incrementaron la proliferación y migración de fibroblastos dermales humanos (hDFa); así mismo, aumentaron la expresión de factores de crecimiento que intervienen en el proceso de cicatrización.

ABSTRACT Objectives. To evaluate the healing effect of a Piper aduncum ethanol-water extract on an adult human dermal fibroblast cell line (hDFa). Materials and Methods. After obtaining the extract via solid-liquid extraction, concentration, and lyophilization, extract proteins were purified using reverse phase high-performance liquid chromatography, identified using tandem mass spectrometry of tryptic peptides, and analyzed using MALDI-TOF-TOF on an ABSciex4800 mass spectrometer. Half maximum effective concentration values (EC50), half maximum inhibiting concentration (IC50), and percentages of cell proliferation were determined using tetrazolium salt assays. Cell migration was evaluated using a "scratch assay". Growth factor expression in cells was analyzed via quantitative real-time reverse transcription polymerase chain reaction. Results. Against the hDFa cell line, the extract had an IC50 of 200 μg/mL and EC50 of 103.5 µg/mL. In the proliferation assay, protein K2 (obtained from the extract) exhibited increased proliferative activity relative to other treatments (1 µg/mL); this agent also exhibited increased activity (50 µg/mL) in the fibroblast migration assay.Furthermore, the relative expression of platelet-derived growth factor increased by 8.6-fold in the presence of K2 protein relative to the control. Conclusions. The hydroethanolic extract of Piper aduncum and its component proteins increased the proliferation and migration of hDFa and increased the expression of growth factors involved in the healing process.

Validación de un método para cuantificar ácido-11-nor-9-carboxi-delta 9-tetrahidrocannabinol en orina por cromatografía gaseosa-espectrometría de masas previa extracción en fase sólida / Validation of a method for quantify 11-nor-9-carboxy-delta 9-tetrahydrocannabinol in human urine using solid phase extraction and gas chromatography-mass spectrometry

El cannabis es una de las drogas ilegales más usadas a nivel mundial. Su consumo se relaciona con diferentes hechos en el ámbito forense, laboral, deportivo y clínico. Para su detección se utilizan métodos con diferentes fundamentos y alcances (inmunológicos, cromatográficos). En este trabajo se describe un método preciso, reproducible y validado, para la cuantificación del principal metabolito urinario del Δ9-tetrahidrocannabinol, el ácido-11-nor-9-carboxi- Δ 9-tetrahidrocannabinol (THC-COOH), por cromatografía gaseosa-espectrometría de masas (GC-MS). Se efectuó una extracción en fase sólida (SPE) a partir de la orina, previa hidrólisis alcalina. Se utilizó el análogo deuterado (THC-COOH D3) como estándar interno. El análisis por GC-MS se realizó en modo SIM. La curva de calibración fue lineal en el rango de trabajo (10-100 ng/ml, r > 0,999) y el límite de cuantificación fue de 10 ng/ml. La recuperación absoluta estuvo comprendida entre el 91,0 y 99,0 %. La precisión intra e inter ensayo fue de 1,06 a 1,26 y 3,59 a 9,80 %, respectivamente. El método fue aplicado a muestras reales, positivas por test inmunológico, resultando ser muy útil y fiable en el análisis de rutina de THC-COOH en orina humana con fines toxicológicos.

Cannabis is one of the most widely used illegal drug in the world. Its consumption is related to different forensic, work, sports and clinical events. In order to determinate the presence of cannabis, different methods with distinct fundamentals and scopes (immunoassay and chromatography) are applied. This report described an accurate, reproducible, and validated gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS) method for the quantitation of 11-nor-9-carboxy- Δ9-tetrahydrocannabinol (THCCOOH), the major metabolite of Δ9-tetrahydrocannabinol in urine. A solid phase extraction (SPE), previous alkaline hydrolysis, was performed on the urine sample. Its deuterated analog (THC-COOH D3) was used as internal standard. The GC-MS analysis made by selected ion monitoring (SIM). Calibration curve was linear over the specified range (10 -100 ng/ml; r > 0.999) and limit of quantitation was 10 ng/ml. Absolute recoveries ranged from 91.0 to 99.0. Intra-assay and inter assay precision ranged from 1.06 to 1.26 and 3.59 to 9.80 %, respectively. The method has been applied to real samples, positive to immunological screening test, resulting to be very useful and reliable in routine analysis of THC-COOH in human urine for toxicological purposes.